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Communications Biology volume

Biologia delle comunicazioni volume 5, numero articolo: 1157 (2022) Citare questo articolo

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La scoperta di anticorpi basata sull’immunizzazione è ostacolata dalla scarsità di cellule B antigene-specifiche. Identificare queste cellule è come trovare un ago in un pagliaio. Le tecnologie attuali ed emergenti, sebbene efficaci, sono limitate in termini di acquisizione del repertorio antigene-specifico. Riportiamo la purificazione in massa delle cellule B antigene-specifiche e i vantaggi che offre a varie piattaforme di scoperta di anticorpi. Utilizzando cinque diversi antigeni, mostriamo tassi di successo del 51-88%, rispetto a circa il 5% con i metodi convenzionali. Mostriamo anche che questa purificazione è altamente efficiente con la perdita di solo il 2% circa di cellule antigene specifiche. Inoltre, abbiamo confrontato i cloni in cui le catene affini sono preservate con quelli delle librerie di visualizzazione in cui le catene delle cellule B totali (TBC) o delle cellule B antigene-specifiche (AgSC) sono state sottoposte ad accoppiamento combinatorio. Abbiamo scoperto che i cloni accoppiati a catena affine e i cloni combinatori della libreria AgSC avevano una maggiore frequenza di cloni funzionali e mostravano una maggiore diversità nella sequenza e nel paratopo rispetto ai cloni della libreria TBC. Questa tecnica di selezione delle cellule B antigene-specifica esemplifica un miglioramento del processo con tempi di ciclo e costi ridotti, rimuovendo i cloni indesiderati prima dello screening e aumentando la possibilità di catturare cloni funzionali desiderabili e rari nel repertorio.

Monoclonal antibodies as a promising therapeutic modality are now widely accepted. As of now there are 129 antibody therapeutics approved or under review in the US and EU1, (August 17, 2020)." href="/articles/s42003-022-04129-7#ref-CR2" id="ref-link-section-d21906725e640"> 2. La rivelazione da parte del gruppo di Dennis Burton che gli anticorpi derivati ​​dalla clonazione di cellule B avevano una maggiore potenza terapeutica rispetto a quelli derivati ​​da librerie combinatorie di pazienti convalescenti dall'HIV3, ha portato a un'impennata degli sforzi per scoprire anticorpi terapeutici da animali immunizzati o pazienti convalescenti4,5 ,6,7,8,9,10,11,12. Tuttavia, la scoperta di anticorpi da animali immunizzati o pazienti convalescenti è un processo complesso a causa della scarsità di cellule antigene-specifiche in una vasta diversità del repertorio complessivo di anticorpi. La frequenza delle cellule antigene-specifiche, anche dopo una forte reazione immunitaria, è solo compresa tra lo 0,01 e lo 0,1% delle cellule B totali13,14,15. Ciò crea una sfida formidabile anche per le piattaforme di screening più avanzate per sfruttare l’intero repertorio immunitario. Pertanto, le piattaforme che si basano sull’immunizzazione degli animali, o sull’uso di cellule B di pazienti convalescenti, si occupano di un’enorme abbondanza di cellule irrilevanti, portando a un elevato attrito tra lo screening e l’identificazione dei risultati antigene-specifici. Un approccio popolare allo screening approfondito del repertorio immunitario consiste nel creare librerie di fagi immunizzati, molte delle quali sono state segnalate come una buona fonte di potenti anticorpi16,17,18. Tuttavia, durante la costruzione delle librerie di visualizzazione immunitaria, le coppie di catene affini provenienti dalla piccola percentuale di cellule antigene-specifiche subiscono un ampio accoppiamento combinatorio con il vasto repertorio di catene di cellule non antigene-specifiche19. Nonostante tali accoppiamenti combinatori, l'accoppiamento affine dei genitori è probabilmente mantenuto a una bassa frequenza18. Abbiamo ipotizzato che aumentare la frequenza degli accoppiamenti della catena affine parentale costruendo e analizzando la libreria immunizzata generata da cellule B antigene-specifiche (AgSC), potrebbe fornire un maggiore successo nell'estrazione del repertorio antigene-specifico.

Le cellule B antigene-specifiche vengono comunemente isolate mediante sorting di cellule attivate mediante fluorescenza (FACS)6,7,8,9,10,11,12,20,21. Sebbene la citometria a flusso funzioni bene per la clonazione di singole cellule B, il suo utilizzo per l'isolamento in massa è limitato dalla sua velocità e dal duro effetto che il campo elettromagnetico può avere sull'integrità cellulare ad alta velocità di smistamento22, portando a una significativa perdita di quantità e qualità delle cellule23. Pertanto, sono necessari metodi delicati ma efficaci per isolare l'AgSC dagli animali immunizzati per interrogare il repertorio immunitario in profondità e in ampio. Abbiamo sviluppato una tecnica di selezione in massa di cellule B di memoria antigene-specifica (MBC) semplice ma potente per l'identificazione rapida ed efficace di IgG monoclonali da topi immunizzati. Questa tecnica si basa sul fatto che gli MBC esprimono IgG di superficie e lo smistamento cellulare assistito da nanoparticelle magnetiche (MACS) può essere impiegato per selezionare rapidamente MBC antigene-specifici in condizioni blande utilizzando antigeni biotinilati.

50,000 paired reads per pool and the sequence analysis was performed using our internal analysis tool. For our analysis, we only used the sequences that were observed at least twice in the sequencing run. We identified a total of 2000 unique VH sequences in the AgSC library and 2033 unique VH sequences in the TBC library pools. Although, antigen-specificity of these clones were not verified, the dominant gene families observed in the Sanger data (IGHV1-18, IGHV1-24, IGHV1-46, IGHV3-11, IGHV3-33, and IGHV4-34) were similarly represented in the NGS data (Supplementary Fig. 2). Similar to the Sanger data, we observed a high representation of IGHV3-11 gene family in the NGS data among the AgSC samples (206) in comparison to the TBC clones (121). On the contrary, the gene families IGHV4-34 and IGHV6-1, which were not represented among the AgSC clones in the Sanger data, were observed in the NGS dataset. Additionally, several new gene families (IGHV1-2, IGHV1-8, IGHV3-23, IGHV3-30, IGHV3-48, IGHV3-7, IGHV4-39, IGHV4-59, IGHV5-51) that were not observed in the Sanger data among both the libraries, were observed at a minor level in the NGS dataset (Supplementary Fig. 2). Since the Sanger sequencing was done with antigen specific clones while the NGS was done with the total eluate from panning rounds, it is possible that these sequences represent non-specific background phage. It is also possible that they are low frequency sequences not represented among the samples investigated for antigen specific screening and Sanger sequencing./p> 50 °C for all clones (Supplementary Fig. 4). We did not observe a significant difference in the thermal stability of Fabs from clones of either libraries against the antigen C or D (Supplementary Fig. 4a, b)./p>

About eight to ten-week-old Trianni mice (HHKK) (Trianni, San Francisco, USA) (2018)." href="/articles/s42003-022-04129-7#ref-CR42" id="ref-link-section-d21906725e2166"42 were used in all studies. All experiments were approved and conducted according to the guidelines of Sanofi Genzyme Institutional Animal Care and Use Committee. Mice were immunized with 50 µg of antigen in adjuvant (Sigma, catalog no. S6322) by intraperitoneal injection, and booster immunizations were performed for four to six times in two-week intervals. Sera were collected after third and last immunization to assess the antibody titers. The mice were rested for three weeks and boosted three days before harvesting secondary lymphoid tissues for processing B cells for antigen selection./p>95% on the day of transfection. Cell suspension (0.5 ml) was prepared to a final density of 3 × 106 cells/ml with Fresh Expi293 media into each well of 96-deep well culture plate (Fisher Scientific, catalog no. 07-000-873). Paired IgG1 heavy and kappa chain linear expression cassettes (LECs) were mixed (500 ng each) in 50 µl of Opti-MEM I medium. Separately, 5 µl ExpiFectamine 293 Reagent (Fisher Scientific, catalog no. A14524) was diluted in 50 µl of Opti-MEM (Fisher Scientific, catalog no. 31985062). The diluted ExpiFectamine 293 Reagent was then mixed with the DNA mix and incubated for 20 min at room temperature. This transfection mix was added to the Expi293F cell suspension in each well of the culture plate and mixed gently. The culture plate was sealed with porous Aeraseal film (Sigma Aldrich, catalog no. A9224-50EA) and incubated at 37 °C, 8% CO2, 900 rpm in a humidified (≥80%) incubator. After 18 h, a cocktail of Enhancer I and II (comes with the ExpiFectamine 293 Reagent kit; 5 µl of Enhancer 1 and 50 µl of Enhancer 2) was added to each well. The cells were incubated for another 120 h in 37 °C, 8% CO2, 900 rpm in a humidified (≥80%) incubator. Cell culture supernatant was harvested by centrifuging the culture plates at 1000 g for 30 min and the supernatants were transferred to Matrix 96-well storage tubes (Fisher Scientific, catalog no. 50-823-846). Antibody concentration in the culture supernatant was measured by Octet (ForteBio) and specific binding to the target antigen was tested by ELISA./p>

Binding with the target antigen was also tested through a cell-based assay, wherein, phage supernatants (50 µl) from individual colonies as used for ELISA, were incubated with wild type CHO cells and CHO cells expressing antigen D on the cell surface (30,000 cells/well) for 1 hr at RT. Cells were then washed three times with PBS-BSA-1% and further incubated with 50 µl/well of pre-conjugated mouse anti-M13 antibody (1:500 dilution) and Alexa-647 labelled anti-mouse antibody (1:200 dilution) (Invitrogen, catalog no. A28181) in dark at RT for 1 hr. Cells were then washed thrice with PBS-BSA-1%, suspended in 100 µl of PBS-BSA-1% and acquired in an iQue flow cytometry system (Sartorius) to evaluate binding of individual samples. The data was analyzed using Forcyte software (2020)." href="/articles/s42003-022-04129-7#ref-CR43" id="ref-link-section-d21906725e3135"43. Irrelevant Fab expressing negative control phage particles were also used as controls./p> (August 17, 2020)./p> (2018)./p> (2020)./p>